Sebelum bergabung dengan Queen pada tahun 1970, May sudah pernah bermain bersama Taylor dalam band progressive rock bernama Smile saat ia masih kuliah. Setelah Mercury bergabung, Queen menjadi lengkap dengan kedatangan bassist John Deacon pada tahun 1971. Mereka menjadi salah satu band rock terbesar di dunia berkat kesuksesan album A Night at the Opera dan singel "Bohemian Rhapsody". Dari pertengahan 1970-an hingga 1986, Queen tampil di beberapa venue terbesar di dunia, termasuk penampilan yang diakui di Live Aid pada tahun 1985. Sebagai anggota Queen, May dianggap sebagai musisi virtuoso dan dikenal dengan suara khas yang dihasilkan melalui permainan gitar berlapis, sering menggunakan gitar listrik buatannya sendiri yang disebut Red Special. May menulis banyak hits untuk Queen, termasuk "We Will Rock You", "I Want It All", "Fat Bottomed Girls", "Flash", "Hammer to Fall", "Save Me", "Who Wants to Live Forever" dan "The Show Must Go On".
Setelah kematian Mercury pada tahun 1991, kecuali konser tribute pada tahun 1992, rilisan album Made in Heaven (1995), dan singel tribute kepada Mercury berjudul "No-One but You (Only the Good Die Young)" pada tahun 1997 (ditulis oleh May), Queen mengalami hiatus selama beberapa tahun, tetapi akhirnya dipulihkan oleh May dan Taylor untuk tampil dengan vokalis lainnya. Pada tahun 2005, dalam jajak pendapat Planet Rock, May terpilih sebagai gitaris terhebat ketujuh sepanjang masa. Ia menduduki peringkat ke-33 dalam daftar 250 gitaris terhebat sepanjang masa versi Rolling Stone pada tahun 2023. Pada tahun 2012, ia menduduki peringkat kedua sebagai gitaris terhebat dalam jajak pendapat pembaca majalah Guitar World. Pada tahun 2001, May diinduksi ke dalam Rock and Roll Hall of Fame sebagai anggota Queen, dan pada tahun 2018, Queen menerima Grammy Lifetime Achievement Award. May diangkat sebagai Komandan Orde Kehormatan Britania Raya (CBE) pada tahun 2005 atas jasanya dalam industri musik dan karyanya di bidang amal.
May meraih gelar doktor dalam bidang astrofisika dari Imperial College London pada tahun 2007, dan menjabat sebagai Kanselir Universitas Liverpool John Moores dari tahun 2008 hingga 2013. Ia juga menjadi anggota tim ilmiah dalam misi Pluto New Horizons NASA. May adalah salah satu pendiri kampanye kesadaran Asteroid Day. Asteroid 52665 Brianmay dinamai sesuai namanya. Pada tahun 2023, May berkontribusi dalam misi OSIRIS-REx NASA, misi pertama yang berhasil mengumpulkan dan mengirimkan sampel langsung dari sebuah asteroid (asteroid Bennu) ke Bumi. May juga seorang aktivis hak-hak hewan, memperjuangkan larangan berburu rubah dan pembunuhan badger di Inggris. Pada tahun 2023, May dianugerahi gelar kesatria oleh Raja Charles III dalam New Year Honours atas jasanya dalam bidang musik dan amal.