Film ini menceritakan awal mula persahabatan antara Shaggy Rogers dan seekor anjing liar yang bisa berbicara, yang kemudian ia beri nama Scooby-Doo. Keduanya bertemu saat masih kecil dan langsung menjadi sahabat dekat.

Pada suatu malam Halloween, Shaggy dan Scooby bertemu tiga anak lain, Fred, Daphne, dan Velma. Saat mereka menjelajahi sebuah rumah berhantu, mereka berhasil menangkap "hantu" yang ternyata hanya pencuri berkostum. Pengalaman itu membuat mereka memutuskan membentuk tim pemecah misteri bernama Mystery Inc.

Sepuluh tahun kemudian, Mystery Inc. sudah menyelesaikan banyak kasus misteri. Namun masalah muncul ketika seorang investor bernama Simon Cowell ingin bekerja sama dengan mereka, tetapi menilai Scooby dan Shaggy justru menghambat tim.

Merasa tidak dihargai, Scooby dan Shaggy akhirnya meninggalkan kelompok tersebut. Tidak lama setelah itu, mereka diserang oleh robot kecil misterius bernama Rottens. Untungnya mereka diselamatkan oleh pahlawan bertopeng Blue Falcon, rekannya Dee Dee Skyes, dan anjing robot Dynomutt.

Serangan robot itu ternyata bagian dari rencana penjahat terkenal Dick Dastardly. Ia ingin menangkap Scooby karena hanya Scooby yang bisa membuka gerbang dunia bawah yang berkaitan dengan legenda anjing monster berkepala tiga, Cerberus.

Sementara itu Fred, Daphne, dan Velma juga mencoba mengungkap rencana jahat tersebut. Mereka akhirnya mengetahui bahwa Dastardly ingin membuka gerbang Underworld untuk menyelamatkan anjingnya, Muttley, yang terjebak di sana saat mencoba mencuri harta.

Petualangan membawa mereka hingga ke Messick Mountain dan akhirnya ke Athena, tempat gerbang dunia bawah berada. Setelah berbagai aksi kejar-kejaran dan pertarungan melawan Cerberus, Mystery Inc. akhirnya berhasil menghentikan rencana Dastardly.

Persahabatan Scooby dan Shaggy juga diuji ketika Shaggy rela berkorban untuk menutup gerbang dunia bawah. Namun akhirnya mereka semua kembali bersatu dan berhasil mengalahkan musuh.

Setelah semuanya selesai, Mystery Inc. kembali bersama dan membuka markas baru untuk melanjutkan petualangan memecahkan misteri berikutnya.