Di kerajaan Dor, yang terkenal dengan sup lezatnya, perayaan tahunan 'Royal Soup Day' berlangsung meriah. Seorang pelaut bernama Pietro datang bersama tikus peliharaannya, Roscuro. Chef Andre, koki andalan kerajaan, menciptakan hidangan istimewa dengan bantuan Boldo, jin kuliner ajaib yang tinggal di dalam panci.

Namun rasa penasaran Roscuro membawanya masuk ke ruang perjamuan kerajaan. Tanpa sengaja, ia jatuh ke dalam sup milik Ratu Rosemary, yang membuat sang ratu terkena serangan jantung dan meninggal dunia. Tragedi ini membuat suasana kerajaan berubah drastis.

Roscuro kemudian ditinggalkan oleh Pietro dan terpaksa bertahan hidup di ruang bawah tanah kastil. Ia bergabung dengan komunitas tikus yang dipimpin Botticelli Remorso, meski sulit menyesuaikan diri dengan kehidupan mereka yang keras.

Sementara itu, Raja Philip yang berduka melarang segala hal yang berhubungan dengan sup dan menyatakan tikus sebagai makhluk terlarang. Akibatnya, Chef Andre tak bisa lagi memasak, Boldo menghilang, dan kerajaan Dor perlahan jatuh ke dalam kemiskinan dan kesedihan. Putri Pea pun merasakan kesepian di tengah kondisi kerajaan yang memburuk.

Di sisi lain, di sebuah desa tikus dalam gudang dapur yang terbengkalai, lahirlah Despereaux dari keluarga Tilling. Sejak lahir, ia sudah terlihat berbeda, bertelinga besar, tidak buta, dan tidak menangis seperti tikus lain. Saat tumbuh, Despereaux dikenal berani dan penuh rasa ingin tahu, berbeda dari tikus lain yang penakut.

Kakaknya, Furlough, mencoba mengajarinya menjadi 'tikus yang benar' dengan mengunyah buku di perpustakaan kerajaan. Namun Despereaux justru tertarik membaca dan terpesona oleh cerita- cerita di dalamnya. Suatu hari, ia bertemu Putri Pea dan berjanji akan melanjutkan kisah tentang putri yang terjebak.

Namun ketika diketahui bahwa Despereaux melanggar aturan tikus karena berbicara dengan manusia, orang tuanya, Lester dan Antoinette, menyerahkannya ke dewan tikus demi menghindari hukuman.