Amélie Poulain lahir pada tahun 1974 dan dibesarkan oleh orang tuanya yang eksentrik. Karena salah mengira bahwa Amélie menderita kelainan jantung, mereka memutuskan untuk mendidiknya di rumah. Untuk mengatasi kesepiannya, Amélie mengembangkan imajinasi yang hidup dan kepribadian yang nakal. Ketika berusia enam tahun, ibunya, Amandine, tewas setelah seorang turis asal Kanada yang berniat bunuh diri melompat dari atap Notre-Dame de Paris dan menimpanya. Akibat tragedi itu, ayahnya, Raphaël, semakin menarik diri dari pergaulan.

Amélie meninggalkan rumah pada usia 18 tahun dan bekerja sebagai pelayan di Café des 2 Moulins di Montmartre, tempat yang dipenuhi orang-orang eksentrik baik di antara para staf maupun pelanggannya. Ia hidup sendiri dan membiarkan imajinasinya berkelana bebas, menemukan kebahagiaan dalam hal-hal sederhana seperti mencelupkan tangannya ke dalam karung biji-bijian, memecahkan permukaan crème brûlée dengan sendok, dan melempar batu di Kanal Saint-Martin.

Pada 31 Agustus 1997, saat terkejut mendengar berita kematian Putri Diana, Amélie menjatuhkan penutup botol parfum plastik, yang membuat sebuah ubin dinding terlepas dan memperlihatkan sebuah kotak logam tua berisi kenang-kenangan masa kecil yang disembunyikan oleh seorang anak laki-laki yang pernah tinggal di apartemennya beberapa dekade sebelumnya. Amélie memutuskan untuk mencari anak laki-laki itu dan mengembalikan kotak tersebut. Ia berjanji pada dirinya sendiri bahwa jika pengembalian itu membuat sang pria bahagia, ia akan mendedikasikan hidupnya untuk membawa kebahagiaan kepada orang lain.

Setelah bertanya pada penjaga apartemen dan beberapa penghuni lama mengenai identitas anak laki-laki itu, Amélie bertemu dengan tetangganya yang penyendiri, Raymond Dufayel, seorang seniman penderita penyakit tulang rapuh yang setiap tahun melukis ulang karya Pierre-Auguste Renoir Luncheon of the Boating Party (1881). Dufayel mengingat bahwa nama anak laki-laki itu adalah “Bretodeau”. Amélie akhirnya menemukan pria itu, Dominique Bretodeau, dan diam-diam mengembalikan kotak tersebut kepadanya. Terharu oleh kenangan yang dibangkitkan oleh kotak itu, Bretodeau memutuskan untuk berdamai dengan putrinya yang telah lama terpisah dan cucu yang belum pernah ia temui. Melihat hasilnya, Amélie pun dengan gembira memulai misi barunya untuk menyebarkan kebahagiaan.