Di hari Natal, Jim Dear memberi istrinya, Darling, hadiah seekor anak anjing American Cocker Spaniel. Anak anjing itu diberi nama Lady. Seiring tumbuh dewasa, Lady berteman dengan anjing- anjing tetangga, yaitu Trusty si Bloodhound yang sudah tua dan Jacqueline si Scottish Terrier yang galak, alias 'Jock'.

Di sisi lain, ada Tramp, anjing campuran Schnauzer yang hidup bebas di jalanan. Ia sering mencuri makanan dan bikin pusing petugas penangkap anjing bernama Elliot, yang memberi cap Tramp sebagai anjing 'berbahaya' dan bertekad menangkapnya. Tramp kemudian bersembunyi di lingkungan tempat Lady tinggal.

Suatu hari, Lady diusir dari pesta baby shower oleh Bibi Sarah, tanpa mengerti alasan perubahan sikap majikannya. Salah mengira suara Tramp sebagai Trusty, Lady curhat padanya. Tramp menyimpulkan bahwa Darling sedang hamil dan memperingatkan Lady bahwa 'when a baby moves in, a dog moves out'. Setelah tahu identitas asli Tramp, Lady mengusirnya dan menolak percaya. Namun setelah bayi perempuan bernama Lulu lahir dan Jim serta Darling makin sibuk, Lady mulai bertanya-tanya apakah perkataan Tramp benar.

Saat Jim dan Darling pergi mengunjungi saudara Jim, mereka menitipkan Lady pada Bibi Sarah. Ketika Sarah pergi ke lantai atas, dua kucing Devon Rex miliknya merusak ruang tamu dan menyalahkan Lady. Tanpa pikir panjang, Sarah membawa Lady ke toko hewan untuk dipasangkan moncong penutup. Ketakutan, Lady kabur ke gang dan nyaris diserang anjing jalanan bernama Isaac, sebelum akhirnya diselamatkan oleh Tramp.

Lady dan Tramp menghabiskan hari bersama di kota, termasuk makan malam spaghetti dan bakso di restoran Tony. Lady mengungkapkan ketakutannya bahwa pemiliknya tak lagi menginginkannya. Tramp mengaku ia dulu punya keluarga, tapi ditinggalkan setelah pemiliknya punya anak. Momen itu terputus ketika Elliot datang dan tanpa sengaja menangkap Lady, lalu membawanya ke penampungan anjing.

Di sana, dua anjing bernama Peg dan Bull membicarakan sifat egois Tramp, membuat Lady meragukan alasan Tramp tak menyelamatkannya. Akhirnya, Jim dan Darling menemukan Lady di penampungan dan membawanya pulang. Mereka mengusir Bibi Sarah beserta kucing-kucingnya, dan Lady pun kembali dekat dengan Lulu.