Di New York City, Larry Daley adalah pria yang bercerai dan bercita-cita menjadi penemu, namun hidupnya tak menentu karena sering berpindah pekerjaan dan tempat tinggal. Mantan istrinya, Erica, masih bersimpati, tetapi menganggap Larry bukan panutan yang baik bagi putra mereka, Nick Daley.

Nick bahkan mulai mengidolakan tunangan Erica, Don, yang sukses sebagai trader, membuat Larry khawatir kehilangan tempat di hati anaknya. Kesempatan datang saat Cecil Fredericks, penjaga malam tua di American Museum of Natural History, merekrut Larry meski latar belakangnya kurang meyakinkan.

Museum yang sedang kesulitan keuangan itu berencana mengganti beberapa penjaga lama, termasuk Reginald dan Gus, dengan satu orang saja. Sebelum mulai bekerja, Cecil memberi Larry buku panduan dan peringatan misterius, jangan biarkan apa pun masuk atau keluar.

Malam pertama Larry berubah jadi kekacauan ketika ia menyadari kerangka Tyrannosaurus rex hidup dan mengejarnya. Setelah mengikuti petunjuk, ia berhasil menenangkannya dan menamai dinosaurus itu 'Rexy'.

Ia kemudian menemukan bahwa seluruh koleksi museum hidup setiap malam berkat Tablet Emas milik Ahkmenrah. Larry bertemu berbagai sosok unik, mulai dari monyet usil Dexter, patung Moai yang suka memanggilnya 'Dum- Dum', hingga miniatur peradaban dan tokoh sejarah seperti Attila the Hun.

Ia juga diselamatkan oleh sosok Theodore Roosevelt versi patung lilin, yang menjelaskan rahasia kehidupan di museum. Bersama Roosevelt, Larry berusaha menjaga ketertiban sekaligus mulai memahami tanggung jawab barunya, dan menemukan kembali rasa percaya diri sebagai ayah.