One Hundred and One Dalmatians menghadirkan kisah seru tentang Roger Radcliffe (Ben Wright), Anita Radcliffe (Lisa Davis), serta dua anjing Dalmatian mereka, Pongo (Rod Taylor) dan Perdita (Cate Bauer). Konflik utama datang dari sosok antagonis ikonik Cruella de Vil (Betty Lou Gerson), yang terobsesi dengan bulu hewan. Film animasi klasik dari Walt Disney Productions ini mengambil latar London tahun 1950-an dan langsung menyuguhkan cerita ringan yang perlahan berubah menjadi petualangan menegangkan.

Cerita dimulai ketika Pongo merasa dirinya dan Roger membutuhkan pasangan. Ia pun mempertemukan Roger dengan Anita di taman, yang juga ditemani anjing Dalmatian bernama Perdita. Meski pertemuan pertama mereka cukup kacau, keduanya akhirnya jatuh cinta dan menikah. Kehidupan mereka semakin lengkap ketika Perdita hamil dan bersiap melahirkan 15 anak anjing yang menggemaskan.

Namun, kebahagiaan itu terganggu oleh kedatangan Cruella de Vil, teman lama Anita yang terkenal eksentrik dan terobsesi pada mantel bulu. Ia menunjukkan ketertarikan besar pada anak-anak anjing tersebut dan bahkan mencoba membelinya. Roger menolak tegas, membuat Cruella marah dan diam-diam merencanakan balas dendam. Beberapa minggu kemudian, ia menyewa dua penjahat, Jasper dan Horace Badun, untuk menculik kelima belas anak anjing tersebut.

Pongo dan Perdita yang putus asa akhirnya menggunakan jaringan komunikasi anjing di seluruh Inggris yang dikenal sebagai "Twilight Bark" untuk mencari bantuan. Usaha mereka membuahkan hasil ketika pesan itu sampai ke seekor anjing penjaga bernama Colonel di Suffolk. Bersama kucing bernama Sergeant Tibbs, mereka menemukan bahwa anak-anak anjing tersebut disekap di kediaman Cruella, bersama puluhan Dalmatian lain yang juga diculik.

Mengetahui rencana keji Cruella yang ingin menjadikan mereka mantel bulu, Pongo dan Perdita segera berangkat menyelamatkan anak-anak mereka. Dengan bantuan Colonel dan Tibbs, mereka berhasil membebaskan seluruh 99 anak anjing dari cengkeraman para penculik. Tidak hanya itu, mereka memutuskan untuk mengadopsi semua anak anjing lain demi menyelamatkan mereka dari nasib buruk.

Perjalanan pulang pun penuh tantangan, karena Cruella terus mengejar mereka dengan amarah. Dengan kecerdikan dan bantuan beberapa teman, para Dalmatian berhasil menyamar dan akhirnya lolos dari kejaran. Mereka pun kembali ke London tepat saat Natal, mengejutkan Roger dan Anita dengan kehadiran seluruh keluarga besar mereka. Roger kemudian memutuskan menggunakan hasil royalti lagunya untuk membeli rumah besar di pedesaan agar bisa merawat 101 Dalmatian tersebut.