Agen OSS Marissa Wilson tetap menjalankan misi meski sedang hamil sembilan bulan. Ia mengejar penjahat bernama Tick Tock yang mencuri mini-disk rahasia berisi data senjata berbahaya bernama Proyek Armageddon. Setelah berhasil menangkapnya, Marissa melahirkan putri kecil bernama Maria dan mencoba menjalani hidup normal bersama suaminya, Wilbur, serta dua anak tirinya, Rebecca dan Cecil.

Setahun kemudian, ancaman baru muncul ketika seorang kriminal misterius bernama Penjaga Waktu mengaku mempercepat jalannya waktu di seluruh dunia. Ia menuntut Safir Chronos, batu ajaib yang ternyata ada di kalung milik Rebecca. Marissa dipanggil kembali ke OSS untuk menjalankan misi, tetapi permintaannya mengambil kalung itu justru membuat hubungan dengan Rebecca semakin renggang.

Saat anak buah Tick Tock menyerang rumah, Rebecca dan Cecil menemukan rahasia besar bahwa ibu tiri mereka adalah mata-mata. Mereka juga mengetahui anjing peliharaan mereka, Argonaut, ternyata robot bersenjata yang bisa bicara. Dibantu Carmen Cortez, keduanya masuk ke markas OSS dan mulai ikut terlibat dalam misi berbahaya.

Penyelidikan membawa mereka pada fakta mengejutkan: Penjaga Waktu sebenarnya adalah Danger D'Amo, bos OSS sendiri. Ia ingin menggunakan Proyek Armageddon untuk kembali ke masa lalu dan menghabiskan waktu bersama ayahnya, setelah masa kecilnya hancur akibat eksperimen waktu yang gagal. Ia pun membekukan para agen OSS dan mengacaukan banyak kota.

Rebecca dan Cecil akhirnya menyadarkan Danger bahwa waktu tak bisa diulang, tetapi harus dihargai saat ini. Danger mencoba kembali ke masa lalu, lalu kembali sebagai versi tua dirinya dan sadar usahanya sia-sia. Ia pun menghentikan mesin tersebut, sementara Tick Tock ditangkap Wilbur yang akhirnya berdamai dengan keluarganya.

Di akhir cerita, Carmen dan Juni Cortez menghidupkan kembali program Spy Kids. Rebecca dan Cecil direkrut menjadi agen baru, membuka jalan bagi generasi mata-mata muda berikutnya.