EO membuka kisahnya dengan sudut pandang yang tak biasa, menempatkan seekor keledai sebagai pusat cerita. Film ini menampilkan Sandra Drzymalska sebagai Kasandra, perempuan sirkus yang penuh kasih, bersama karakter EO si keledai yang menjadi saksi bisu dunia manusia. Lewat perjalanan EO, kita diajak menyusuri fragmen-fragmen kehidupan yang indah sekaligus kejam, diceritakan dengan gaya reflektif khas film arthouse Eropa.

Awalnya, EO hidup sebagai bagian dari sebuah sirkus di Polandia. Ia tampil bersama Kasandra yang benar-benar menyayanginya dan selalu berusaha melindunginya. Hubungan mereka terasa hangat dan tulus, sampai akhirnya para aktivis hak hewan menutup sirkus tersebut. EO dipisahkan dari Kasandra dan dipindahkan ke sebuah kandang kuda. Di sana, ia melihat kuda-kuda yang dirawat dengan penuh perhatian, berlari bebas, dan dimanja manusia. Namun keberadaan EO justru dianggap mengganggu, apalagi setelah ia tanpa sengaja menjatuhkan rak penuh piala. Ia pun kembali dipindahkan, kali ini ke sebuah peternakan.

Di peternakan, EO terlihat murung dan kehilangan selera makan. Ia menjalani hari-hari dengan mengantar anak-anak menungganginya menyusuri hutan, di tengah pemandangan pohon-pohon yang ditebang. Suatu malam, Kasandra diam-diam datang menjenguk EO. Ia membawa muffin wortel untuk merayakan ulang tahun EO dan mengucapkan, "may all your dreams come true." Setelah Kasandra pergi, EO mencoba mengejarnya, menerobos pagar, namun justru tersesat di hutan gelap.

Perjalanan EO semakin surreal saat ia berjalan di tengah hutan dan menyaksikan kehidupan non-manusia di sekitarnya. Pemburu dengan senapan berlaser mulai menembak, dan EO melihat seekor serigala yang terluka parah. Ia kemudian tiba di kota kosong, terpaku pada akuarium berisi ikan tropis di etalase toko. Tanpa sengaja, EO masuk ke sebuah pertandingan sepak bola, dan ringkikannya mengacaukan tendangan penalti. Insiden ini membuat tim yang kalah murka, sementara tim pemenang justru membawa EO ke bar. Malam itu, bar dirusak oleh tim yang kalah, dan EO dipukuli hingga hampir mati.

EO diselamatkan dan dibawa ke rumah sakit hewan. Di sana, muncul pertanyaan sinis tentang mengapa nyawanya masih layak diselamatkan. Setelah itu, EO dipaksa bekerja di pabrik bulu, menyaksikan rubah-rubah dibunuh dengan kejam. Dalam kepanikan, EO menendang seorang pekerja hingga tak sadarkan diri. Ia kembali dipindahkan, kali ini bersama hewan-hewan lain dalam sebuah truk. Perjalanannya membawanya bertemu Mateo sang sopir, lalu seorang pastor bernama Vito, hingga akhirnya EO kembali berjalan sendirian, menyeberangi jembatan batu di depan bendungan besar.