Pada tahun 1912, Pramuka Henry "Indiana" Jones, Jr. tinggal bersama ayahnya, Henry Jones, Sr., di Moab, Utah. Suatu hari, saat menjelajahi sebuah gua, Indiana mengambil sebuah salib milik Coronado dari sekelompok perampok makam, dan setelah pengejaran singkat dengan kuda serta berhasil meloloskan diri di atas kereta sirkus, ia pulang ke rumahnya. Namun, perampok makam itu menemukan Indiana dan mengambil kembali salib tersebut dengan bantuan sheriff. Pemimpin perampok, Garth, mengakui rasa hormatnya terhadap Indiana dan memberinya topi fedora sebelum pergi.

Pada tahun 1938, Indiana berhasil merebut kembali salib tersebut dari majikan perampok di lepas pantai Portugal. Setelah kembali ke Amerika Serikat, Indiana mengetahui bahwa ayahnya hilang saat mencari Cawan Suci. Walter Donovan, penyokong finansial ayahnya, menugaskan Indiana untuk menemukan Henry sekaligus Cawan Suci.

Indiana menerima paket berisi buku harian Henry, yang memuat penelitiannya tentang Cawan Suci, dan pergi ke Venesia bersama Marcus Brody untuk menemui rekan ayahnya, Dr. Elsa Schneider. Di bawah perpustakaan tempat Henry terakhir terlihat, Indiana dan Elsa menemukan katakombe yang berisi perisai bertuliskan yang menunjukkan bahwa jalan menuju Cawan Suci dimulai di Alexandretta. Keduanya kemudian diserang oleh kelompok misterius yang ternyata adalah Persaudaraan Rahasia Pedang Salib, yang berdedikasi untuk melindungi Cawan Suci.

Setelah menyelamatkan nyawa pemimpin kelompok, Kazim, Indiana mengetahui bahwa Henry ditahan di Kastil Brunwald di Austria. Indiana mempercayakan Marcus dengan peta dari buku harian yang menunjukkan rute ke Cawan Suci dan mengirimnya ke Alexandretta untuk bertemu dengan teman mereka, Sallah. Setelah menemukan kamar mereka telah dirampok, Indiana memberitahu Elsa tentang keberadaan buku harian sebelum mereka menghabiskan malam bersama.