Miles Morales, remaja asal New York City, hidup di antara tekanan dan harapan besar dari ayahnya, Jefferson Davis, seorang polisi yang justru menganggap Spider-Man sebagai pengacau. Suatu hari, pamannya, Aaron, mengajaknya ke stasiun bawah tanah yang terbengkalai untuk membuat grafiti dan melupakan stres sejenak. Tapi siapa sangka, di sanalah hidup Miles berubah selamanya. Seekor laba-laba radioaktif menggigitnya, dan tiba-tiba ia punya kekuatan luar biasa mirip dengan Spider-Man.

Penasaran, Miles kembali ke tempat itu dan menemukan sebuah mesin raksasa buatan Kingpin, seorang penjahat besar yang ingin membuka portal ke alam semesta paralel demi menghidupkan kembali istri dan anaknya yang sudah tiada, Vanessa dan Richard. Spider-Man muncul untuk menghentikannya, tapi pertarungan melawan Green Goblin dan Prowler membuat situasi berantakan.

Green Goblin mendorong Spider-Man ke dalam mesin, menyebabkan ledakan besar yang membuat sang pahlawan sekarat. Sebelum menghembuskan napas terakhirnya, Spider-Man sempat memberikan flash drive khusus kepada Miles, satu-satunya alat untuk menghancurkan mesin tersebut, sambil memperingatkan bahwa kota bisa hancur kalau alat itu diaktifkan lagi.

Miles hanya bisa menyaksikan dengan ngeri ketika Kingpin membunuh Spider- Man. Dunia pun berduka, dan Miles bertekad untuk meneruskan warisan sang pahlawan. Namun saat mencoba, ia justru tak sengaja merusak flash drive yang seharusnya menyelamatkan kota.

Mampukah Miles belajar menjadi pahlawan sejati dari sosok Spider-Man yang bahkan sudah kehilangan semangatnya sendiri? Dan apakah ia bisa menyelamatkan kota sebelum Kingpin menghidupkan kembali mesin yang bisa menghancurkan segalanya?