Dua tahun setelah kejadian film pertama, Larry Daley meninggalkan pekerjaannya sebagai penjaga malam di American Museum of Natural History dan memulai bisnis menjual penemuannya lewat televisi. Saat kembali berkunjung, ia mengetahui bahwa sebagian besar koleksi museum akan dipindahkan ke arsip Smithsonian Institution dan digantikan dengan tampilan hologram.

Lebih buruk lagi, Tablet milik Ahkmenrah tetap tinggal, sehingga benda-benda yang dipindahkan tidak lagi bisa hidup di malam hari. Kekacauan pun terjadi ketika Larry menerima telepon panik dari koboi mini Jedediah.

Ia mengabarkan bahwa monyet usil Dexter telah mencuri tablet, membuat Smithsonian hidup, namun kini diserang oleh kakak Ahkmenrah, Kahmunrah. Tanpa ragu, Larry berangkat ke Washington, D.C. dan menyamar sebagai penjaga malam untuk menyusup ke dalam museum.

Di sana, ia menemukan teman-temannya terjebak oleh Kahmunrah yang berniat menggunakan kekuatan tablet untuk membuka gerbang dunia bawah dan menguasai dunia. Dalam misinya, Larry dibantu oleh tokoh-tokoh bersejarah seperti George Armstrong Custer dan pilot legendaris Amelia Earhart, yang kemudian menjalin kedekatan dengannya.

Petualangan semakin menegangkan saat Kahmunrah merekrut tokoh-tokoh terkenal seperti Napoleon Bonaparte, Ivan the Terrible, dan Al Capone untuk merebut kembali tablet. Larry sempat tertangkap dan diberi waktu untuk memecahkan rahasia tablet.

Dalam pelariannya, ia dan Amelia menjelajahi berbagai bagian museum, bertemu tokoh-tokoh sejarah penerbangan seperti Wright brothers, hingga akhirnya menemukan petunjuk penting untuk menghentikan rencana jahat Kahmunrah.